Применение хемилюминесценции и флуоресценции 

При хемилюминесцентном вестерн-блоттинге хемилюминесценция возникает, когда хемилюминесцентный субстрат, такой как люминол или 1,2-диоксетан, присоединенный к антителу, связанному с вашим целевым белком, подвергается ферментной реакции. При флуоресцентном вестерн-блоттинге вы присоединяете флуорофор, такой как Alexa Fluor®, IRDye®, DyLight™ или Qdot®, к вторичному или третичному антителу, которое связывается с вашим целевым белком.

Для визуализации хемилюминесцентных полос на блоте вам просто понадобится темная комната, но для обнаружения флуоресцентных полос необходимо возбудить их с помощью источника света высокой интенсивности. Хемилюминесценция и флуоресценция генерируют световое излучение, которое можно визуализировать с помощью CCD-камеры. При использовании правильных технологий захвата изображений вы можете использовать хемилюминесценцию и флуоресценцию для обнаружения белков, которые экспрессируются на низком уровне на ваших вестерн-блотах.

Хемилюминесцентный вестерн-блоттинг

Хемилюминесцентный вестерн-блоттинг — лучшая методика, если вам необходимо высокочувствительное определение одного белка. Использование систем Syngene G:BOX Chemi или G:BOX mini CCD для визуализации ECL и CDP-Star® хемилюминесцентных вестерн-блотов дает более широкий динамический диапазон, чем пленка, позволяя безопасно и точно определять фемтограммовые уровни белка.

Используя управляемое протоколом программное обеспечение GeneSys для систем G:BOX Chemi и G:BOX mini, вы просто выбираете хемилюминесцентный субстрат, а программное обеспечение автоматически фиксирует одно или серию изображений, обеспечивая получение идеально экспонированного изображения без лишних хлопот, связанных с использованием пленки.

Хемилюминесцентный вестерн-блот

Первичное антитело (1°) связывается с целевым белком на мембране. Затем мембрана инкубируется с хемилюминесцентным субстратом, например, HRP. Происходит ферментативная реакция с выделением света, который регистрируется CCD-камерой.

Флуоресцентный вестерн-блоттинг

Флуоресцентный вестерн-блоттинг — это метод, который следует использовать, если вы хотите визуализировать несколько различных белков и количественно сравнить их, поскольку в отличие от хемилюминесценции, которая дает только белый свет, каждый тип флуорофора излучает свет разного цвета. Поэтому вы можете использовать несколько флуоресцентных молекул одновременно для обнаружения различных целевых белков на одном блоте. Эти красители флуоресцируют при высокой интенсивности УФ-, RGB- или ИК-освещения, обеспечивая гибкость мультиплексирования без потери сигнала из-за снятия и повторного зондирования вашего блота. В отличие от хемилюминесценции, флуоресцентные сигналы обладают большей стабильностью во времени, что означает линейность и точность результатов.

С помощью специальных фильтров и опций HI-LED RGB и ИК-освещения вы можете быстро получить изображение мультиплексных флуоресцентных белков, используя системы Syngene G:BOX Chemi или G:BOX mini. Программное обеспечение GeneSys системы автоматически выбирает наилучшую комбинацию освещения и фильтров для получения изображения каждого красителя. Затем вы можете получить одно или несколько изображений вашего пятна и наложить на них различные цветные изображения. Это означает, что вы можете получить одно полное изображение всех ваших различных флуоресцентных белков, что делает визуализацию и точный анализ каждого из них быстрой и простой задачей.

Мультиплексный флуоресцентный вестерн-блоттинг

Флуоресцентный мультиплекс между двумя различными флуорофорами. Первичные антитела (1°) связываются с целевыми белками на мембране. Затем мембрана инкубируется с вторичными антителами (2°), конъюгированными с различными флуорофорами. Затем мембрана визуализируется с помощью Hi-LED источников света, которые возбуждают каждый флуорофор по отдельности и генерируют флуоресценцию для каждого флуорофора, которая фиксируется CCD-камерой.