Выбор наилучшего источника света для экспериментов по флуоресценции 

Существует множество источников света, которые можно использовать для освещения образца во время экспериментов по широкопольной флуоресцентной микроскопии. Для выбора наиболее подходящего из них необходимо оценить свойства источников света и взвесить их плюсы и минусы. Здесь мы рассмотрим возможности трех широко используемых источников света и обсудим их свойства, а также преимущества и ограничения, чтобы помочь вам принять обоснованное решение о том, какой источник лучше всего подходит для вашего эксперимента.

При выборе наилучшего источника света для вашего исследования необходимо учитывать множество факторов, включая:

• мощность/интенсивность;
• спектр;
• соединение с микроскопом;
• управление с помощью программного обеспечения сторонних производителей;
• общий срок службы;
• стабильность с течением времени;
• стоимость покупки;
• стоимость обслуживания;
• энергопотребление.

В широкопольной флуоресцентной микроскопии обычно используются такие источники света, как светоизлучающие диоды (СИД), ртутные или ксеноновые дуговые лампы или вольфрамо-галогенные лампы. Наиболее распространенными источниками света, используемыми сегодня, являются светоизлучающие диоды (СИД); по своим свойствам они обычно превосходят дуговые и вольфрамо-галогенные лампы, которые чаще использовались в прошлом.

В этой таблице приведен обзор свойств этих источников света:

	Светодиоды	Вольфрам-галоген	Ртутная или ксеноновая дуговая лампа
Длины волн	Каждый отдельный светодиод излучает узкий диапазон длин волн. Несколько светодиодов охватывают широкий спектр от УФ до ИК	320-2500нм Диапазон ультрафиолетового и видимого света, излучаемый одной лампой	200-1800нм Диапазон ультрафиолетового и видимого света, излучаемый одной лампой
Интенсивность	Высокая	Низкая	Высокая
Срок службы (часы)	10,000	2000	Ртуть: 200-300 Ксенон: 400-600
Уменьшение яркости в течение жизни	Нет	Да (меньше, чем дуговые лампы)	Да
Плюсы	Не вырабатывается избыточное тепло Не требуют выравнивания ламп Недорого с течением времени Интенсивность можно точно регулировать с помощью электроники Компактный Идеально подходит для многоцветной визуализации живых клеток Не требуются жалюзи или подогрев/охлаждение Можно включать/выключать мгновенно, что уменьшает фотообесцвечивание	Легко заменить Более равномерная интенсивность, чем у дуговых ламп Относительно недорогой Предварительно выровненный Идеально подходит для визуализации живых клеток	Можно использовать для очень тусклой флуоресценции Пики высокой интенсивности на длинах волн, возбуждающих многие широко используемые флуорофоры
Минусы	Каждая длина волны света требует отдельного светодиода из-за узкой полосы излучения, если только у вас нет светодиодного источника, излучающего несколько длин волн Светодиоды не излучают длины волн в низкой ультрафиолетовой части спектра Высокая первоначальная стоимость	Интенсивность может быть слишком низкой, чтобы визуализировать слабые флуорофоры При высоких температурах длина излучаемых волн короче Уменьшение яркости в течение срока службы	Дорого Необходимо выравнивание для равномерного освещения Длительное время разогрева Выделяют много избыточного тепла Нуждаются в размещении в специальных жилых помещениях Лампы должны быть утилизированы как опасные отходы Фильтры нейтральной плотности необходимы для снижения фотообесцвечивания и фототоксичности при визуализации живых клеток Уменьшение яркости в течение срока службы

Интенсивность и спектр

Источник света, используемый в эксперименте по флуоресцентной микроскопии, должен излучать свет определенной длины волны, который возбуждает флуорофоры, присутствующие в образце. Этот свет должен излучаться с достаточно высокой интенсивностью, чтобы стимулировать как можно больше флуоресцентного излучения.

Часто используются источники белого света, поскольку белый свет содержит все длины волн света в видимом спектре с одинаковой интенсивностью. Это означает, что конкретные длины волн в этом диапазоне могут быть выбраны с помощью фильтров возбуждения.

Рисунок 1: электромагнитный спектр включает УФ-излучение, видимый свет и ИК-волны, которые испускаются различными источниками света, используемыми в широкопольной флуоресцентной микроскопии.

Возбуждающие фильтры выбирают необходимую конкретную длину волны, но, поскольку они не подавляют весь периферийный свет, источник света должен иметь высокую интенсивность в спектре возбуждения флуорофора. Это предотвращает нежелательное возбуждение других флуорофоров в образце, а также повреждение образца светом.

Необходимая интенсивность света может зависеть от образца, который вы визуализируете. При визуализации живых клеток лучше использовать более низкую интенсивность возбуждающего света, чтобы избежать повреждения клетки в результате фотообесцвечивания и фототоксичности. В то время как для освещения больших полей зрения или когда требуется высокая скорость для визуализации изменений в образце, необходимы источники света более высокой интенсивности.

Дуговые лампы

Ртутные и ксеноновые дуговые лампы — это источники белого света, излучающие широкий диапазон длин волн от ультрафиолетового (УФ) до инфракрасного (ИК). Они имеют множество интенсивных полос на длинах волн в ультрафиолетовом и видимом спектре и излучают яркий ультрафиолетовый свет. Поскольку они охватывают весь видимый спектр, при использовании нового красителя фильтр-куб может отфильтровать новую длину волны возбуждающего света с помощью той же лампы.

Однако дуговые лампы не обеспечивают равномерную интенсивность освещения по всему спектру видимого света; основные пики приходятся на ближние ультрафиолетовые длины волн, а два других пика находятся в зеленой/желтой части спектра. Пики приходятся на длины волн 313, 334, 365, 405, 436, 546 и 579 нм, оставляя пробелы в областях, которые возбуждают многие важные флуорофоры, такие как флуоресцеин и флуо-4.

Рисунок 2: Спектры возбуждения и испускания флуоресцеина; пиковая длина волны возбуждения составляет 494 нм, что не является пиковой длиной волны, излучаемой дуговыми лампами.

Ксеноновые дуговые лампы имеют более постоянную интенсивность во всем спектре по сравнению с ртутными. Эта интенсивность выше в ИК-диапазоне, что означает выделение большого количества избыточного тепла, которое может повредить живые образцы.

Поскольку дуговые лампы излучают свет высокой интенсивности, неподвижные образцы могут пострадать от фотообесцвечивания, если не использовать фильтры нейтральной плотности для снижения интенсивности света или не уменьшить время экспозиции.

В отличие от светодиодов, интенсивность света в дуговых или вольфрамо-галогенных лампах нельзя точно контролировать. Это связано с тем, что интенсивность регулируется с помощью фильтров нейтральной плотности или ирисовых диафрагм. Эти фильтры имеют ограниченный контроль интенсивности, поскольку они позволяют регулировать интенсивность в нескольких дискретных диапазонах, а не изменять ее с меньшим шагом.

Вольфрамо-галогенные лампы

Спектр вольфрамо-галогенных ламп похож на спектр дуговых ламп, с более низкой пиковой интенсивностью и более равномерным освещением по всему полю зрения. Вольфрамо-галогенные лампы предварительно выравниваются, что экономит время и усилия.

Когда один микроскоп будет использоваться для различных экспериментов, наиболее подходящими являются источники света, способные излучать большой диапазон длин волн. Для этих целей лучше всего подходят вольфрамо-галогенные лампы, поскольку они могут излучать волны в видимом диапазоне света при достаточно высокой мощности для возбуждения флуорофоров. Однако эти лампы имеют слабое излучение в ультрафиолетовой части спектра, поэтому дуговые лампы больше подходят для визуализации образцов, требующих длины волны ниже 400 нм.

Вольфрамо-галогенные лампы выделяют много избыточного тепла. Это может привести к ускоренному разрушению образца, поэтому для предотвращения этого необходим теплоблокирующий фильтр.

Светодиоды

Светодиоды - это твердотельные полупроводниковые приборы, которые излучают свет напрямую, без использования лампы. Светодиоды могут излучать свет в видимом диапазоне с дискретными, узкими пиками возбуждения. Интенсивность светодиодов можно точно регулировать с шагом в 1%. Интенсивность может быть больше, чем у ртутных ламп в синей и красной областях возбуждения, но слабее, чем у ртутных ламп в зеленой области возбуждения. Светодиоды излучают свет меньшей интенсивности на длинах волн в ультрафиолетовой части спектра. Самая низкая длина волны излучаемого света составляет 340 нм, поэтому некоторые УФ-красители не могут быть возбуждены светодиодами.

Светодиоды позволяют быстро переключаться между длинами волн, что означает, что в одном и том же образце в ходе одного эксперимента можно возбудить несколько флуорофоров. Они особенно подходят для быстрой многоцветной визуализации.

Срок службы и стабильность

Дуговые лампы

Дуговые лампы имеют средний срок службы всего 500 часов, их яркость со временем снижается, и их нельзя быстро включать и выключать, так как это сокращает срок их службы. Поскольку им требуется время на разогрев, прежде чем они достигнут пика интенсивности, дуговые лампы обычно включаются на более длительное время, что еще больше сокращает количество часов их использования для получения изображений образцов.

Вольфрамо-галогенные лампы

Срок службы вольфрамо-галогенных ламп составляет 2000 часов, их яркость со временем снижается, но гораздо меньше, чем у дуговых ламп, что делает их более экономичным источником света по сравнению с дуговыми лампами.

Светодиоды

Светодиодные источники света имеют самый длительный срок службы, и их яркость не уменьшается со временем. Длительный срок службы и стабильность светодиодов означает, что они отлично подходят для экспериментов, продолжающихся в течение многих дней или недель. Светодиоды подходят для автоматизированных экспериментов, поскольку все изображения могут быть получены при одинаковых условиях возбуждения от начала и до конца. Им не требуется время на разогрев или охлаждение, поэтому их можно использовать сразу после включения. Это также сокращает время включения светодиодов, тем самым продлевая срок их службы.

Цена покупки и стоимость обслуживания

Дуговые лампы

Дуговые лампы недороги в приобретении. Однако, поскольку срок службы ламп невелик, их необходимо утилизировать как опасные отходы и выравнивать при каждой замене для обеспечения равномерного освещения, они не являются экономичным вариантом.

Вольфрамо-галогенные лампы

Вольфрамово-галогенные лампы также относительно дешевы в приобретении. Хотя они служат более чем в четыре раза дольше дуговых ламп, в течение срока службы светодиодов лампы, скорее всего, придется менять несколько раз. Избыточное тепло, выделяемое вольфрамо-галогенной лампой, может привести к сокращению срока службы деталей микроскопа; замена этих деталей увеличивает стоимость применения ламп.

Светодиоды

Светодиоды имеют самую высокую начальную стоимость. Однако они часто оказываются более экономичными благодаря низким эксплуатационным расходам, длительному сроку службы и стабильности. Расходы на обслуживание снижаются, так как их не нужно выравнивать или утилизировать как опасные отходы. Светодиоды более энергоэффективны, чем другие источники света, что позволяет экономить деньги на электричестве.

Поскольку светодиодам не требуется время для разогрева, их не нужно оставлять включенными на весь день, чтобы преодолеть время разогрева, а можно включать и выключать мгновенно. Это также означает, что не нужны жалюзи, что позволяет добиться дополнительной экономии и предотвратить вибрации от жалюзи, которые могут помешать проведению электрофизиологических экспериментов.

Совместимость с микроскопом

Наиболее удобным способом подключения источника света к микроскопу является его установка непосредственно на микроскоп. Однако в случае дуговых и вольфрамо-галогенных ламп это может привести к нагреву и вибрации (из-за вентиляторов охлаждения) микроскопа. Это может повредить образец и нарушить получаемые изображения. Чтобы уменьшить эти помехи, источники света, установленные на микроскопе, часто делают менее мощными, чтобы уменьшить производимое тепло и вибрации.

Поэтому обычно предпочтительнее устанавливать системы с жидкими световодами, которые доставляют свет к микроскопу, когда источник удален. Жидкие световоды являются передатчиками высокоинтенсивного света. Они могут быть изготовлены из различных материалов, способных пропускать ультрафиолетовый, видимый и инфракрасный свет. Использование жидких световодов снижает электрические шумы и вибрации в микроскопах. Они также снижают мощность света из-за потерь на связь, но это часто не является проблемой из-за высокой интенсивности света.

Дуговые лампы

Дуговые лампы могут располагаться в дугоразрядных ламповых патронах микроскопа. Поскольку дуговые лампы должны быть выровнены для равномерного освещения образца, в цоколе лампы требуются центрирующие винты, которые позволяют центрировать изображение в объективе. Ламповому гнезду также необходим ИК-фильтр для блокировки длин волн в ИК-диапазоне и, следовательно, тепла.

Ламповый корпус должен иметь выключатель, который автоматически выключает дуговую лампу, если корпус случайно открывается при включенной лампе. Он также не должен пропускать ультрафиолетовые волны, которые могут быть вредны, и должна быть способна выдержать взрыв горелки дуговой лампы.

Подача света от дуговых ламп через жидкий световод обеспечивает равномерное освещение по всему полю зрения, а также снижает нагрев и вибрации микроскопа.

Вольфрамо-галогенные лампы

Вольфрамо-галогенные лампы также часто содержатся в ламповом корпусе. Ламповый корпус присоединяется к микроскопу с помощью фирменного монтажного фланца. ИК-фильтр перед коллекторной линзой поглощает большое количество нежелательных ИК-волн и тепла. Дополнительные фильтры обычно могут быть вставлены в световой тракт для выбора определенных диапазонов длин волн или могут быть вставлены фильтры нейтральной плотности, уменьшающие амплитуду света.

Светодиоды

Светодиодные источники света обычно управляются с помощью дистанционного пульта, который располагается рядом с микроскопом. Это позволяет исследователю переключать длину волны в многоволновых системах и регулировать интенсивность одновременно с рассмотрением образца.

В качестве альтернативы светодиоды могут быть интегрированы в микроскоп или пакет программного обеспечения для обработки изображений. Это позволяет автоматизировать процесс, и преимущество возможности быстрого переключения становится более значительным.

В многоцветных системах визуализации светодиоды находятся в "световом двигателе" и обычно соединены с микроскопом через жидкий световод.

Безопасность

Важно никогда не смотреть прямо на включенный источник света, не подключенный к микроскопу. При тестировании источника света направляйте его на неотражающую поверхность, чтобы не повредить глаза.

Дуговые лампы

Дуговые лампы генерируют высокий уровень ультрафиолетового излучения, которое может повредить человеческий глаз. Поэтому для снижения риска получения травмы они требуют использования УФ-фильтра.

При использовании ртутных дуговых ламп необходимо следить за тем, чтобы лампы заменялись по истечении рекомендованного срока службы. Это поможет снизить риск взрыва лампы и выделения в воздух паров ртути, которые являются токсичными.

Существуют также строгие требования к утилизации ртутных ламп как опасных отходов. Это может занять много времени и стоить дорого.

Вольфрамо-галогенные лампы

Вольфрамово-галогенные лампы также излучают ультрафиолетовый свет. Прямой взгляд на ультрафиолетовый свет в течение длительного времени может привести к долгосрочным повреждениям. Для экспериментов, предполагающих длительное наблюдение за образцом, потребуется тепловой/УФ-фильтр.

Светодиоды

Поскольку светодиоды излучают свет вне УФ-спектра, они гораздо безопаснее дуговых и вольфрамо-галогенных ламп, поскольку излучаемый свет не вызывает дискомфорта или повреждения глаз. Светодиоды также не несут риска выделения токсичных химических веществ, что делает их самым безопасным источником света.